style="width:7.16669in;height:3.44937in" /> 本文是学习GB-T 33120-2016 梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了梨疱状溃疡类病毒的检疫鉴定方法。
本标准适用于进出境梨树种苗、组培苗及植株中梨疱状溃疡类病毒的检疫和鉴定。
学名：Pear blister canker viroid。
缩写：PBCVd。
异名：梨泡斑类病毒。
分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),苹果锈皮类病毒属(Apscaviroid)。
传播途径：通过嫁接、芽接和刀具机械传播，但没有有关介体及种子传毒的报道。远距离通过种苗
调运传播。
梨疱状溃疡类病毒的其他信息参见附录 A。
根据梨疱状溃疡类病毒全长 RNA
核酸链中的保守区域设计了一对扩增该类病毒全长核酸的引 物，进行RT-PCR
扩增和序列测定；根据梨疱状溃疡类病毒全长核酸序列设计与正单链 RNA
互补的单
链 RNA 探针，通过杂交信号强弱进行结果判定。
超净工作台、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器、微量进样器、垂
直电泳槽、PCR
仪、凝胶成像系统、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪等。
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 RT-PCR
试剂见附录B;分子杂交试剂见附录 C。
取样品量1%～5%(若样品少可适量增大比例)的种苗进行检查。检查梨疱状溃疡类病毒侵染症
状，树皮上形成疱状物或树皮开裂、溃疡、鳞状表皮或表皮深裂，树势衰退。
GB/T 33120—2016
RT-PCR 检测见附录B。
分子杂交检测见附录C。
在每次检测中阴性对照和空白对照均表现为阴性，而阳性对照表现为阳性，则说明检测体系可靠，
在此条件下，如果样品经 RT-PCR
和分子杂交两种检测方法均为阳性反应，并经测序验证，则可判定样
品中带有梨疱状溃疡类病毒；如果RT-PCR
检测和杂交检测结果均为阴性，则可确定样品不带有梨疱
状溃疡类病毒。
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨疱状溃疡类病毒的样品应嫁接在砧木上，温室大
棚种植隔离保存，同时-70℃超低温保存，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法、RT-PCR
检测结果图片、核
苷酸测定序列、分子杂交检测结果图片等，并要有实验人员和审核人员签字。
GB/T 33120—2016
(资料性附录)
梨疱状溃疡类病毒其他信息
A.1 地理分布
法国、西班牙、意大利、日本、希腊、突尼斯、马耳他、阿根廷、中国(湖北和新疆)。
A.2 寄主范围
目 前 报 道 的 寄 主 范 围 限 于 蔷 薇 科 (Rosaceae) 的 梨 属 (Pyrus)、
苹 果 属 (Malus) 和 山 楂 属 (Crataegus)
植物。梨属种包括杜梨(P.betulifolia)、 豆梨(P.calleryana)、
西洋梨(P.communis)、 沙
梨(P.serotina)雪梨(P.nivalis)等；苹果和山楂属的个别种如山丁子(M.baccata)、
八棱海棠(M.robusta) 和山楂(C. monogyna)等。
A.3 基因组特征
梨疱状溃疡类病毒为一共价闭合环状的单链 RNA 分子，长约314个碱基。
序列(NCBI 登陆号：NC 001830) 如下：
CUUUCCUGAGGUUCCUGUGGUGCUCCCCUGACCUGCGUUCCAAAAAGCGAAAAAGUGAGAGGCCCU
AGGGGCUUCUCGGCUCGUCGUCGACGAAGGGUCUAGAAGCCUGGGCGCUGGCUGGAGCGCGCGGCU
GUGAGUAAUCGCUCCUUUGGAGAAGAAAACCAGCGUUGCUUCCUGCCUGAGCCUCGUCUUCUG
UCCCGCUAGUCGAGCGGACAACCCGAGCACCGCCGAAGCGCUUUUUUCUUUUAUAGCAGCUUGG
CUUCGCGGCGAGGGUGGAAGUUUACCGCGGACCCCCGAGAGGAGGCCCUCGGGUCC
A.4 症状
梨疱状溃疡类病毒能潜伏侵染很多西洋梨(P.communis)
商业品种，叶片及果实不表现任何病理
症状。在一些敏感品种上仅在树皮上表现症状，侵染的第二年在树皮上形成疱状物或树皮开裂，并逐步
转变为溃疡、鳞状表皮或表皮深裂，进而树势衰退，导致梨树得病后5年～8年死亡。图
A.1 为该病毒 在不同梨品种枝干上的溃疡症状。
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a) 在A20上的症状 b\|) 在A20上的症状 c)
在考密斯上的症状
注：引自
http://www-intranet.angers.inra.fr/dossiers/virus/fichvir3.html。
图 A.1 梨疱状溃疡类病毒在不同梨品种枝干上的溃疡症状
GB/T 33120—2016
(规范性附录)
RT-PCR 检测方法
B.1 试 剂
B.1.1 核酸提取和 RT-PCR 相 关 试 剂
DEPC 处理超纯水：取制备好的去离子水500 mL, 加入500 μL
DEPC摇床振荡过夜，高温高压灭 菌后室温保存。
1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0):称取12.11g Tris,加50 mL
DEPC处理超纯水溶解，用浓 HCl 调 pH 值
至8.0,定容至100 mL, 高温高压灭菌后室温保存。
0.5 mol/L EDTA(pH 8.0):称取18.61g Na₂EDTA ·2H₂O,加80 mL
处理超纯水溶解，用约2 g
NaOH 调 pH 值至8.0,加DEPC100μL, 定容至100 mL,
摇床振荡过夜，高温高压灭菌后室温保存。
10×TE(pH 8.0):取 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)10mL和0.5 mol/LEDTA(pH 8.0)2
mL,加
50mL DEPC处理超纯水溶解，定容至100 mL, 高温高压灭菌后室温保存。
10×STE 溶液：取1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)10 mL、5 mol/L NaCl 20 mL和0.5
mol/L EDTA
(pH 8.0)2mL,加50 mLDEPC 处理超纯水溶解，调pH 值至6.8,定容至100 mL,
高温高压灭菌后室
温保存。
10% SDS:称取10 g SDS,加80 mL 超纯水溶解，定容至100 mL 后室温保存。
3 mol/L 乙酸钠(pH 5.2)溶液：称取40.8g NaAc ·3H₂O,加40 mL
超纯水溶解，用冰乙酸调 pH
值至5.2,定容至100 mL, 加40 μL DEPC摇床振荡过夜，高温高压灭菌后室温保存。
酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1):取饱和酚25 mL、 三氯甲烷24 mL、 异戊醇1
mL, 充分混匀 后，用TE(pH 8.0)覆盖，棕色瓶中保存。
三氯甲烷：异戊醇(24:1):取三氯甲烷48 mL、 异戊醇2 mL, 充分混匀后，TE(pH
8.0)覆盖，棕色 瓶中保存。
反转录酶 M-MLV、dNTPs、RNA 酶抑制剂(Rnasin)、TaqDNA 聚合酶和CF-11
纤维素。
B.1.2 PAGE 凝胶电泳的相关试剂
30%丙烯酰胺：在70mL 蒸馏水中加入29 g 丙烯酰胺(acrylamide,Acr)和 1 g
N,N'-亚甲基双丙
烯酰胺(N,N'-methylene-bis-acrylamide,Bis),加热溶解后，定容至100 mL,
置棕色瓶中室温保存。
10%过硫酰铵：称取0.5 g 过硫酰铵溶于5 mL 蒸馏水中，4℃保存。
5×TBE 贮备液：称取54gTris,27.5g 硼酸，加20 mL0.5 mol/L
EDTA(pH8.0),溶解于适量蒸 馏水，最后用蒸馏水定容至1 L,室温保存。
50×TAE: 称取242gTris,溶解于适量蒸馏水，加入57.1 mL 冰乙酸，100 mL500
mmol/L EDTA
(pH 8.0),最后用蒸馏水定容至1 L,室温保存。
B.2 引 物
正向引物：5'-GTCTGAAGCCTGGGCGCTGG-3'
反向引物：5'-CCTTCGTCGACGACGAGCCGAG-3'
目标扩增产物长度为314 bp 左右。
GB/T 33120—2016
B.3 核酸提取
称取0.10 g 叶片，液氮研磨，转入离心管；立即加入600μL1×STE,80μL10%
SDS,400μL 水 饱
和酚，400 μL 三氯甲烷，涡旋10 min,12000 r/min离 心 8 min;
取上清液于新的离心管中，加无水乙醇 至终浓度为30%,加10 mg
纤维素粉，涡旋10 min,5000r/min 离 心 3 min; 弃上清液，沉淀中加1 mL
含30%乙醇的1×STE 溶液洗涤，涡旋3 min,5000 r/min 离 心 3 min,
弃上清液，重复操作3次；沉淀
中加200μL1×STE 洗脱，涡旋3 min,12000 r/min 离 心 5 min;
收集上清液，重复操作两次，合并两次
上清液；加40μL3 mol/L NaAc(pH5.2),1mL无水乙醇， -20℃沉淀30 min
及以上；12000 r/min
离心20 min, 沉淀中加1 mL80% 乙醇，上下颠倒10次，12000 r/min 离 心 5 min,
弃上清液；瞬间离心 20 s,吸去多余液体，室温干燥5 min～10 min,加15μLDEPC
处理的去离子水溶解， 一80 ℃冰箱保存
备用。市售商品化Trizol提取试剂盒不适合梨疱状溃疡类病毒 RNA 提取。
B.4 cDNA 合成
于0.2 mLPCR 管中加入DEPC 处理去离子水10μL、类病毒 RNA 3μL(50 ng～200
ng),随机引
物 1 μL,95℃ (或沸水)水浴7 min, 迅速置冰上冷却3 min;
然后加5×反转录缓冲液4μL、10 mmol/L
dNTPs、40 U/μL RNA 酶抑制剂(Rnasin)0.5μL、200 U/μL 反转录酶(M-MLV)0.5
μL,混 匀 后 3 7 ℃
水 浴 1 h;反转录结束后瞬时离心，95℃(或沸水)水浴5 min, 冰 浴 3 min,
直接进行 PCR。 设置阳性对
照、阴性对照及空白对照。
B.5 PCR 扩增
0.2 mL PCR管中加入10×PCR 缓冲液(含Mg²+)2μL,dNTPs(10
mmol/L)0.5μL,同源和互补
引物(均为10μmol/L) 各0 .5μL,5U/μLTaq DNA 聚合酶0.25μL,模 板 3 μL, 加
DEPC 处理水至总
体积20μL。 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。
反应程序：94℃ 3 min;94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30 s,35个循环；72℃7 min。
B.6 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
琼脂糖凝胶：制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR
扩增产物，用 DNA Marker
作为分子量标记，进行电泳分析。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特
异性DNA 条带，并拍摄记录。
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)
电泳分辨率和灵敏度显著高于琼脂糖，在所检测样品含量较低情况下或
扩增目标条带低的情况下进行 PAGE 电泳分析。
PAGE 电泳分析：配制30mL6% 的非变性聚丙烯酰胺溶液，其组成如下：6 mL30%
聚丙烯酰胺，6 mL 5×TBE,18mL 蒸馏水，200μL10% APS,20μL
TEMED,然后灌制电泳胶。电泳完成后在脱色摇床
上进行硝酸银染色，硝酸银染色步骤如下：凝胶先在固定液(10%乙醇+0.5%乙酸)中固定5
min, 然 后 直接加入10%的硝酸银至终浓度为0 .2%,染色5 min,
倒掉，用蒸馏水洗2次，每次1 min, 然后加入显
色液(3%NaOH+0.5%HCHO)
至显出清晰的条带，蒸馏水冲洗2次，记录结果，封胶保存。
GB/T 33120—2016
B.7 结果判定
阳性对照在314 bp
左右处有扩增片段，而阴性对照和水空白对照无此条带，将该目标条带回收克
隆后经测序验证，与参考序列有90%以上的相似性，则判断为阳性。
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(规范性附录)
分子杂交
C.1 试剂与材料
C.1.1 核酸杂交的相关试剂
20×SSC: 称取175.3g NaCl,88.2g二水柠檬酸钠，溶解于800 mL
去离子水，用HCl 调 pH 值至7.0,
最后用定容至1 L, 高温高压灭菌后室温保存。
50×Denhardt's 溶液：称取1 g Ficoll400,1gPVP-40,1g BSA,溶解于80 mL
去离子水，定容至
100mL, 过滤除菌及杂质后-20℃贮存。
预杂交液：5×SSC、5×Denhardt 溶液、50%甲酸胺、1% SDS、100 μg/mL 鲑鱼精
DNA (用前加热
变性后加入)。
杂交液：预杂交液中加入DIG-RNA 探针，稀释成适当浓度。
封闭液：将0.73 g NaCl,0.24g Na₂HPO₄ ,0.1g NaH₂PO₄ ,5g SDS溶于80 mL
水中，定容至100 mL,
过滤除菌后室温保存。
洗涤液 I: 为1/10稀释的封闭液。
洗涤液Ⅱ:将0.24 g Tris,1.16 g NaCl,0.4g MgCl₂ 溶于160 mL 水中，用 HCl
调 pH 至9.5,定容
至200 mL, 过滤除菌后室温保存。
MOPS 缓冲液(10×):200 mmol/L MOPS(pH 7.0)、50 mmol/L NaAc、10 mmol/L
EDTA。
顺丁烯二酸缓冲液：100 mmol 顺丁烯二酸、150 mmol NaCl,pH 7.5。
洗膜缓冲液：100 mmol 顺丁烯二酸、150 mmol
NaCl、0.3%(体积分数)吐温-20,pH 7.5。
检测缓冲液：100 mmol Tris-HCl(pH 9.5)、100 mmol NaCl。
抗地高辛的酶标抗体：Anti-DIG-AP。
CSPD:25 mmol CSPD(用前稀释)。
C.1.2 标记探针
采用地高辛标记试剂盒进行核酸探针标记。将正链 RNA 互补 cDNA
5'端采用融合了T7 启动子 的互补引物与同源引物(B.2)PCR
扩增，回收目标片段，取1μg 溶于11.5 DEPC 处理水，沸水中变性 5min,
短暂离心后加入4μL5× 转录反应缓冲液、2μL 地高辛标记 dNTPs 和 2 μL T7 RNA
聚合酶、 0.5μLRNA 酶抑制剂，37℃标记反应2 h。 最后加入2μLEDTA(0.5
mol/L,pH 8.0)终止反应，加无 水乙醇-20℃放置30 min 沉淀核酸，12000 r/min
转速离心10 min, 小心弃去乙醇溶液，然后用75%
乙醇洗涤一次，无菌操作台吹干，溶于20μL 纯水中。检测标记效率(C.2.3)
应高于对照1个数量级以
上， 一20℃保存，杂交时放入杂交液中使用。
C.2 实验步骤
C.2.1 样品 RNA 的提取
方法同B.3。
C.2.2 RNA 斑点印迹杂交
步骤如下：
GB/T 33120—2016
a) 取3 μLRNA 加7 μL 变性缓冲液(33%甲醛、50%去离子甲酰胺和1×MOPS),65℃
水浴15 min, 冰浴5 min,促使核酸变性；
b) 然后取变性核酸点于带正电荷的尼龙膜上，每次2μL,点好后将膜晾干；
c) 将膜正面朝上置于胶联仪内，在紫外光强度1200×100μJ/cm²
条件下胶联固定3 min;
d) 将膜用6×SSC 预湿后，放入预杂交液中，在杂交炉68℃预杂交2 h～6h;
e) 然后将探针煮沸5 min,迅速冰上冷却5 min,加入到杂交缓冲液中，65℃杂交6
h～12h;
f) 杂交结束后，将膜取出，用20 mL～40mL 含2×SSC 和0 . 1%SDS
溶液在室温洗膜5 min,重
复1次；
g) 用20 mL～40mL 含0.1×SSC 和0. 1% SDS 溶液在68℃下洗膜15
min,重复1次；
h) 将膜放入杂交袋中用于检测。
C.2.3 杂交检测
采用地高辛检测试剂盒在室温(20℃~25℃)条件下进行杂交结果的检测。按100 cm²
膜面积计
算试剂用量。步骤如下：
a) 洗膜后，用洗液冲洗杂交膜；将膜放入在100 mL 封闭液量内封闭30 min;
b) 利用封闭液按1:10000稀释抗体，将膜放入20 mL 抗体溶液内孵育20 min;
c) 加100 mL 洗液，室温洗膜15 min,重复1次；
d) 加20 mL 检测液，室温孵育2 min～5 min,重复1次；
e) 杂交面朝上，加2 mLCSPD 使其均匀铺在膜上，室温孵育5
min,取出膜沥干溶液，用保鲜膜
包好；
f) 5 min～15 min后置于化学发光检测仪内检测光信号。
C.3 结果判定
阴性对照无或弱的杂交信号，而阳性对照有强的杂交信号，则结果可靠；杂交信号显著比阴性对照
强的判定为阳性样品。
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